Test del T.S.I. ( prova di differenziazione nell’utilizzo degli zuccheri: lattosio, saccarosio e glucosio; per la produzione di Idrogeno solforato e per la produzione di gas dalla fermentazione dei carboidrati)

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Il T. S. I. è un terreno solido usato per una delle tante differenziazioni delle enterobatteriacee, batteri Gram negativi capaci di utilizzare gli zuccheri come substrato con produzione di acidi, con o senza formazione di gas.

Il terreno contiene il sodio tiosolfato che può essere metabolizzato ad ac. Solfidrico, la cui formazione viene evidenziata grazie alla presenza di un sale ferroso che, reagendo con l’acido, forma un precipitato nero di solfato ferroso.

La presenza nel terreno del rosso fenolo (indicatore) rivela la variazione di pH dovuta alla demolizione degli zuccheri con formazione di acidi.

Tecnica di esecuzione (prova effettuata con il terreno solido T.S.I. )

Scopo

Questo terreno solido, utilizzato a becco di clarino, consente di osservare la sola fermentazione del glucosio e/o la fermentazione del lattosio e saccarosio con produzione di acido e/o gas. Lo scopo è quello di differenziare i generi Salmonella e Shigella da tutti gli altri appartenenti alla famiglia dell’Enterobacteriaceae, soprattutto dal genere Escherichia. Infatti sia la Salmonella , sia la Shigella fermentano solo il glucosio con formazione di gas , inoltre alcune specie di Salmonella producono ac. Solfidrico . gli altri generi appartenenti alla famiglia degli enterobatteri, sono tutti in grado di utilizzare,oltre al glucosio , il lattosio e/o il saccarosio. Inoltre per avere un’ulteriore differenziazione , in questo terreno si mette in evidenza anche la produzione di ac. Solfidrico caratteristica di alcuni generi Salmonella e del Proteus

Principio

Il terreno solido, solidificato a becco di clarino, consente la formazione di una camera aerobia (la parte inclinata) ed una parte anaerobia (la parte cilindrica), inoltre i tre zuccheri sono presenti in differenti quantità (1% il glucosio e il 10% il lattosio e saccarosio)questo per ottenere una produzione di acidità nell’ambiente diversa a seconda che sia fermentato solo il glucosio (bassa acidità) o se ,oltre a quest’ultimo, viene utilizzato anche il lattosio e/o il saccarosio (alta acidità ), insieme agli zuccheri è presente anche l’1% di peptone dalla cui demolizione si produce sostanza basica. L’indicatore presente nel terreno rosso fenolo vira dal rosso a pH neutro, al giallo a pH acido, mentre a pH basico vira al rosso fucsia. La tecnica per la semina è mista : nella parte cilindrica è per infissione con ago, mentre nella parte a becco di clarino è per strisciamento con ago o ansa. Il meccanismo su cui si basa l’utilizzo di questo terreno comprende necessariamente , i presupposti suddetti, facciamo un esempio di ciò che accade nel terreno prendendo in considerazione la Salmonella che fermenta solo il glucosio e produce ac. solfidrico : seminata nel terreno, incubata a temperatura idonea (37°C) inizia ad utilizzare il glucosio producendo acidi che fanno virare l’indicatore al giallo in tutto il terreno. Terminato lo zucchero (presente solo all’1%) e non avendo un corredo enzimatico che gli consente di utilizzare entrambe gli altri zuccheri presenti (lattosio e saccarosio) ,il microrganismo attacca le molecole del peptone e le demolisce. Per poter svolgere questa degradazione ha la necessità di un ambiente ossigenato per cui questa metabolismo avviene solo nella parte del terreno a becco di clarino. La basicità prodotta dal metabolismo peptidico è in grado di contrastare e superare, l’acidità prodotta dal metabolismo glucidico solo nella parte aerobica, per cui il terreno da giallo diventa rosso fucsia . Dopo 24h di incubazione il tubo contenente il T.S.I. seminato si presenterà giallo nella parte cilindrica e rosso nella parte a becco di clarino, poiché dalla fermentazione del glucosio si è prodotto gas saranno presenti anche bolle o spaccature evidenti. Inoltre se il genere Salmonella, preso in considerazione, è un produttore di ac. Solfidrico, saranno presenti anche diffuse macchie nere. Prendiamo , invece, in considerazione l’Escherichia coli: 2. una volta seminata nel T.S.I. ed incubata a 37°C, inizia a utilizzare prima il glucosio e dopo il lattosio e il saccarosio producendo una quantità di acidi in grado di far virare l’indicatore al giallo in tutto il terreno e a farlo rimanere tale anche se il microrganismo dovesse metabolizzare il peptone nella parte aerobica. Alla fine del tempo di incubazione il risultato sarà che tutto il terreno risulterà colorato in giallo con bolle e spaccature per la produzione di gas, non saranno, invece presenti macchie nere poiché l’Escherichia non produce l’acido solfidrico o idrogeno solforato

Vetreria :beuta, bacchette, spatola, cilindro graduato, provettoni 18×180 con relativi tappi di metallo, imbuto, pipette sterili, ago.

Strumenti: bilancia, autoclave, stufa, termostato a 37°C, bunsen.

Procedimento

· Scegliere il terreno di coltura: T.S.I.

· Preparare il terreno di coltura, seguendo le istruzioni riportate sulla confezione.

· Pesare la polvere in base ai calcoli della proporzione effettuata, sciogliere in beuta a caldo sul bunsen, tenendo presente che prima della sterilizzazione in autoclave a 121°C , 1 atm, per 15’, il terreno andrà distribuito in provettoni 18x180

· Il terreno sterilizzato , ancora liquido, dovrà essere messo a solidificare in posizione obliqua per ottenere una parte cilindrica ed una a becco di clarino

· Seminare con l’ago una colonia pura per infissione e in superficie per strisciamento , in ambiente sterile .

· Incubare in termostato a 37°C per 24/48h.

microrganismo	cilindro	becco di clarino	H2S
Aerobacter cloacae	acido e gas (AG)	Acido (A)	—
Escherichia coli	acido e gas (AG)	Acido (A)	—
Proteus vulgaris	acido e gas (AG)	Acido (A)	+
Shigella dysenteriae	acido (A)	NC o ALK	—
Salmonella typhosa	acido e gas (AG)	NC o ALK	+

AG ….acido e formazione di gas

A…acido

NC…..nessun cambiamento

ALK….alcalino

+…… idrogeno solforato positivo (nero)

—…… idrogeno solforato negativo (assenza di colore nero)

Preparazione del TSI

Sciogliere a caldo

   Distribuire in provette            

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