Test per la produzione di idrogeno solforato

 

Ci sono microrganismi capaci di produrre idrogeno solforato (H2S) , detto anche acido solfidrico, da substrati organici contenenti amminoacidi con zolfo (cisteina,  metionina) e da substrati inorganici (tiosolfato di sodio). L’azione sulla cisteina è dovuta ad un enzima: la ”cisteina desulforasi” , secondo la seguente reazione:                                       

                                                        cist. desulforasi

                                     cisteina                                            ac.     piruvico  +  H2S  +  NH3

 

mentre la produzione di  H2S  dai prodotti inorganici solforati  ( solfati, solfiti e tiosolfati) è dovuta ad una reazione redox mediata da un enzima, ad esempio:

 

                                                         

                                                             tiosolfato reduttasi

S2O3=    +   8 e -  +  10 H +                                                 2 H2S  +  3 H2O

 

La presenza di un metallo pesante agisce quale indicatore e la produzione di idrogeno solforato è messa in evidenza dalla formazione di un precipitato nero di solfuro ferroso.

La ricerca della produzione di  H2S  è anche un’ulteriore prova di conferma nella differenziazione delle enterobatteriaceae.

Per  questo test si possono utilizzare diversi tipi di terreni di coltura:  TSI, SIM, agar SS, ecc.

 

 

scopo

 Osservare la capacità del microrganismo in esame di  produrre una quantità più o meno elevata si idrogeno solforato

principio

La  capacità di produrre idrogeno solforato è una caratteristica  di alcuni Enterobatteri . Il  terreno di coltura  utilizzato è un agar semimolle ,che viene così definito perché ha una percentuale  di agar inferiore ad un terreno solido comune. Si utilizza solidificato  in  forma cilindrica, in provettoni  , e deve contenere o cisteina o metionina o tiosolfato di sodio per liberare S—che, unendosi ad H+, prodotto dal microrganismo, formeranno H2S  . E’ necessaria, poi, la presenza di un metallo pesante (ferro, bismuto o piombo) che, reagendo con l’H2S, darà un precipitato nero.

 

 

 

 

 

 

materiale

Terreno di coltura :  SIM medium

Vetreria : beuta, bacchette, spatola, cilindro graduato, provettoni 18×180 con relativi tappi di metallo,  imbuto, ago.

Strumenti: bilancia, autoclave, stufa, termostato a 37°C, bunsen.

 

 

 

 

procedimento

 

·   Scegliere il terreno di coltura:  SIM (in  alternativa anche il TSI o SS agar).

·   Preparare il terreno di coltura, seguendo le istruzioni riportate sulla confezione.

·   Pesare la polvere in base ai calcoli della proporzione effettuata, sciogliere in beuta a caldo sul bunsen.

·   Raffreddare e distribuire nei provettoni , in una quantità variabile a seconda della grandezza scelta (circa 15ml nei provettoni  18×180).

·   Sterilizzare il terreno in autoclave a 121°C, 1atm, per 20’.

·   Una volta effettuata la sterilizzazione mettere i tubi contenenti il terreno in posizione diritta  a  solidificare. Si  deve ottenere un cilindro che  verrà seminato per infissione.

·   Seminare con l’ago  una colonia pura in profondità , in ambiente sterile .

·   Incubare in termostato a 37°C per 24/48h.

·   Effettuare la lettura : la presenza di macchie o colore nero diffuso lungo la linea di semina, rappresenta la capacità del microrganismo di produrre  H2S.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

            

Scioglimento terreno                         Versamento del terreno in provetta       Lettura ed interpretazione dei risultati

Tecnica di esecuzione   (prova effettuata con  il terreno SIM )

 

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