Laboratorio

anno scolastico 2008-2009

Determinazione della presenza di DNA modificato in un campione di alimento

OGM

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Basi teoriche

Il DNA

L'acido desossiribonucleico o deossiribonucleico (DNA) è un acido nucleico che contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto funzionamento della maggior parte degli organismi viventi.Dal punto di vista chimico, il DNA è un polimero organico costituito da monomeri chiamati nucleotidi. Tutti i nucleotidi sono costituiti da tre componenti fondamentali: un gruppo fosfato, il deossiribosio (zucchero pentoso) e una base azotata che si lega al deossiribosio con legame N-glicosidico. Quattro sono le basi azotate che possono essere utilizzate nella formazione dei nucleotidi da incorporare nella molecola di DNA: adenina, guanina, citosina e timina. La disposizione in sequenza di queste quattro basi costituisce l'informazione genetica, leggibile attraverso il codice genetico, che ne permette la traduzione in amminoacidi. Il processo di traduzione genetica (comunemente chiamata sintesi proteica) è possibile solo in presenza di una molecola intermedia di RNA, generata attraverso la trascrizione del DNA. Tale processo non genera solo filamenti di RNA destinati alla traduzione, ma anche frammenti già in grado di svolgere svariate funzioni biologiche (ad esempio all'interno dei ribosomi, dove l'rRNA ha una funzione strutturale). L'informazione genetica è duplicata prima della divisione cellulare, attraverso un processo noto come replicazione del DNA, che evita che si perda informazione durante le generazioni. Negli eucarioti, il DNA si dispone all'interno del nucleo in strutture chiamate cromosomi. Negli altri organismi, privi di nucleo, esso può essere organizzato in cromosomi o meno. All'interno dei cromosomi, le proteine della cromatina (come gli istoni) permettono di compattare e controllare la trascrizione dei geni.

STORIA

IL DNA fu inizialmente isolato dal biochimico svizzero Friedrich Miescher che, nel 1869, individuò una sostanza microscopica contenuta nel pus di bende chirurgiche utilizzate. Dal momento che tale molecola aveva la sua localizzazione nel nucleo, egli la chiamò nucleina. Nel 1919 Phoebus Levene individuò la struttura del nucleotide, composta da base azotata, zucchero e fosfato. Levene suggerì che il DNA consistesse di un filamento di nucleotidi legati tra loro attraverso i fosfati. In ogni caso, Levene era convinto che tale filamento fosse corto e che le basi fossero disposte secondo un preciso ordine ripetuto. Nel 1937 William Astbury presentò i primi risultati di alcuni studi di ^{FRANCIS CRICK}

diffrazione a raggi X, che dimostrarono che il DNA ha una struttura estremamente regolare.Nel 1928, Frederick Griffith scoprì che i caratteri della forma smooth (liscia) di Pneumococcus potevano essere trasferiti alla forma rough (rugosa) miscelando i resti di batteri smooth morti con batteri rough vivi. Questo sistema, pur non fornendo nessuna evidenza su quale fosse la sostanza che determinava il cambiameto, mostrava comunque che qualcosa potesse trasportare l'informazione genetica dai resti dei batteri morti a quelli vivi. Si parlò quindi di un principio trasformante in grado di modificare i batteri vivi. Nel 1943 Oswald Theodore Avery dimostrò, in un celebre esperimento insieme a Colin MacLeod e Maclyn McCarty, che il DNA è il principio trasformante alla base di questo fenomeno. Il ruolo del DNA nell'ereditarietà è stato dimostrato infine nel 1953 da Alfred Hershey e Martha Chase attraverso un altro classico esperimento, che dimostrò che il materiale genetico del fago T2 è effettivamente il DNA.

Il 1953 è anche l'anno in cui, attraverso ulteriori immagini da diffrazione a raggi X realizzate da Rosalind Franklin, chimica-fisica inglese, James Watson e Francis Crick presentarono sulla rivista Nature quello che è oggi accertato come il primo modello accurato della struttura del DNA,^[9] quello della doppia elica. A disegnarne il bozzetto fu Odile Speed, pittrice e moglie di Crick. Le evidenze sperimentali a supporto del modello di Watson e Crick furono riportate in una serie di cinque articoli pubblicati sullo stesso numero di Nature. Tra questi figurava l'articolo della Franklin e di Raymond Gosling, che conteneva i dati di diffrazione a raggi X fondamentali per sostenere il modello. Tale numero conteneva anche un articolo sulla struttura del DNA scritto da Maurice Wilkins. Nel 1962, dopo la morte di Rosalind Franklin (a causa di un tumore provocato, probabilmente, dalle alte dosi di raggi X a cui si era esposta nel corso dei suoi esperimenti), Watson, Crick e Wilkins ricevettero congiuntamente il Premio Nobel per la medicina. Dal momento che la scoperta del modello si basò essenzialmente sui dati di Rosalind Franklin, ancora oggi esistono pareri molto eterogenei nella comunità scientifica su chi avrebbe dovuto ricevere tale premio. ^{JAMES WATSON}

In una importante presentazione del 1957, Crick propose il dogma centrale della biologia molecolare, che fissa le relazioni tra DNA, RNA e proteine. La conferma finale del meccanismo di replicazione basato sulla struttura a doppia elica fu fornita nel 1958 dall'esperimento di Meselson-Stahl. Un successivo lavoro di Crick dimostrò come il codice genetico fosse basato su triplette di basi non sovrapposte, permettendo ad Har Gobind Khorana, Robert Holley e Marshall Warren Nirenberg di decifrarlo. Queste scoperte sono alla base della moderna biologia molecolare.

Composizione

Il DNA è un lungo polimero costituito da unità ripetute di nucleotidi. La catena del DNA è larga tra i 22 ed i 26 Ångström (da 2,2 a 2,6 nanometri) ed ogni unità nucleotidica è lunga 3,3 Ångstrom (0,33 nanometri).Sebbene ogni unità occupi uno spazio decisamente ridotto, la lunghezza dei polimeri di DNA può essere sorprendentemente elevata, dal momento che ogni filamento può contenere diversi milioni di nucleotidi. Ad esempio, il più grande cromosoma umano (il cromosoma 1) contiene quasi 250 milioni di paia di basi. Negli organismi viventi, il DNA non è quasi mai presente sotto forma di singolo filamento, ma come una coppia di filamenti saldamente associati tra loro. Essi si intrecciano tra loro a formare una struttura definita doppia elica. Ogni nucleotide è costituito da uno scheletro laterale, che ne permette il legame covalente con i nucleotidi adiacenti, e da una base azotata, che instaura legami idrogeno con la corrispondente base azotata presente sul filamento opposto. Il composto formato da una base azotata legata allo zucchero è definito nucleoside; un nucleotide è invece un nucleoside a cui sono legati uno o più gruppi fosfato.

La struttura laterale del DNA è composta da unità ripetute ed alternate di gruppi fosfato e di 2-deossiribosio, uno zucchero pentoso (a cinque atomi di carbonio) che si lega ai fosfati adiacenti attraverso legami fosfodiesterici presso il terzo ed il quinto carbonio; in pratica, ogni molecola di fosfato forma un ponte molecolare collegando, attraverso legami fosfodiesterici, il carbonio in posizione 3′ di una molecola di deossiribosio con quello in posizione 5′ dello zucchero successivo. Conseguenza di questi legami asimmetrici è che ogni filamento di DNA ha un senso, determinato dalla direzione dei legami fosfodiesterici. In una doppia elica, il senso di un filamento è opposto a quello del filamento complementare. Per tale motivo, i due filamenti che costituiscono una doppia elica sono detti antiparalleli. Le estremità asimmetriche di un filamento di DNA sono definite estremità 5′ (cinque primo) ed estremità 3′ (tre primo). La principale differenza tra il DNA e l'RNA è lo zucchero pentoso utilizzato: l'RNA utilizza, infatti, il ribosio.

La doppia elica del DNA è stabilizzata dai legami idrogeno che si instaurano tra le basi presenti sui due filamenti. Le quattro basi che sono state individuate nel DNA sono l'adenina (abbreviata con la lettera A), la citosina (C), la guanina (G) e la timina (T). Adenina e guanina sono composti eterociclici chiamati purine, mentre citosina e timina sono anelli pirimidinici. Esiste una quinta base, di tipo pirimidinico, chiamata uracile (U), ma essa non è di norma presente nelle catene di DNA. L'uracile è altresì presente nei filamenti di RNA al posto della timina, da cui si differenzia per la mancanza di un gruppo metile. L'uracile è presente nel DNA solo come prodotto della degradazione della citosina.

La doppia elica è una spirale destrorsa. Con l'avvitarsi su sé stessi dei due filamenti, restano esposti dei solchi tra i diversi gruppi fosfato. Il solco maggiore è largo 22 Å, mentre il solco minore è largo 12 Å. La differente ampiezza dei due solchi si traduce concretamente in una differente accessibilità delle basi, a seconda che si trovino nel solco maggiore o minore. Proteine come i fattori di trascrizione, dunque, solitamente prendono contatto con le basi presenti nel solco maggiore.

Appaiamento delle basi

a destra, un appaiamento GC, caratterizzato da tre legami idrogeno. A sinistra, un appaiamento AT con due legami idrogeno

Ogni tipo di base presente su un filamento forma un legame con la base posta sul filamento opposto. Tale evento è noto come appaiamento complementare. Le basi puriniche formano legami idrogeno con le basi pirimidiniche: A può legare solo T e G può legare solo C. L'associazione di due basi viene comunemente chiamata paio di basi ed è l'unità di misura maggiormente utilizzata per definire la lunghezza di una molecola di DNA. Dal momento che i legami idrogeno non sono covalenti, essi possono esser rotti e riuniti in modo relativamente semplice. I due filamenti possono essere allontanati tra loro, come avviene per una cerniera, sia dalle alte temperature che da un'azione meccanica (come avviene durante la replicazione del DNA).Conseguenza di questa complementarità è che tutte le informazioni contenute nella doppia elica possono essere duplicate a partire da entrambi i filamenti, evento fondamentale per una corretta replicazione del DNA.

I due tipi di paia di basi formano un numero differente di legami idrogeno: A e T ne formano due, G e C tre. Per tale motivo, la stabilità del legame GC è decisamente maggiore di quello AT. Di conseguenza, la stabilità complessiva di una molecola di DNA è direttamente correlata alla frequenza di GC presenti nella molecola stessa, nonché alla lunghezza dell'elica: una molecola di DNA è dunque tanto più stabile quanto più contiene GC ed è lunga. Un'altra conseguenza di tale evento è il fatto che le regioni di DNA che devono essere separate facilmente contengono un'elevata concentrazione di A e T, come avviene ad esempio per il Pribnow box dei promotori batterici, la cui sequenza è infatti TATAAT.

In laboratorio, la stabilità dell'interazione tra filamenti è misurata attraverso la temperatura necessaria a rompere tutti i legami idrogeno, chiamata temperatura di melting (o T_m). Quando tutti i legami idrogeno sono rotti, i singoli filamenti si separano e possono assumere strutture molto variegate.

La stabilizzazione della doppia elica, in ogni caso, non è dovuta ai soli legami idrogeno, ma anche ad interazioni idrofobiche e di pi stacking.

Senso e antisenso

Una sequenza di DNA è definita senso se la sua sequenza è la stessa del relativo mRNA. La sequenza posta sul filamento opposto è invece detta antisenso. Dal momento che le RNA polimerasi lavorano producendo una copia complementare, il filamento necessario per la trascrizione è l'antisenso. Sia nei procarioti che negli eucarioti vengono prodotte numerose molecole di RNA antisenso a partire dalle sequenze senso. La funzione di questi RNA non codificanti non è stata ancora completamente chiarita. Si ritiene che gli RNA antisenso possano giocare un ruolo nella regolazione dell'espressione genica.

Esistono alcune sequenze di DNA, sia in procarioti che in eucarioti (ma soprattutto nei plasmidi e nei virus) in cui la differenza tra sequenze senso ed antisenso è meno chiara, dal momento che le sequenze di alcuni geni si sovrappongono tra loro. In questi casi, dunque, alcune sequenze rivestono un doppio compito: codificare una proteina se lette in direzione 5'→3′ su un filamento; codificarne un'altra se lette sull'altro (sempre in direzione 5'→3′). Nei batteri, questa sovrapposizione genica è spesso coinvolta nella regolazione della trascrizione, mentre nei virus il fenomeno è dovuto alla necessità di contenere in un piccolo genoma un'elevata quantità di informazioni. Un altro modo di ridurre le dimensioni genomiche è quello individuato da altri virus, che contengono molecole di DNA lineare o circolare a singolo filamento.

Superavvolgimento

Il DNA può essere distorto come avviene per una corda attraverso un processo definito superavvolgimento. Quando il DNA è in uno stato rilassato, un filamento percorre un giro completo intorno all'asse ogni 10.4 paia di basi. Se invece il DNA è distorto, il numero di basi può aumentare o diminuire. Lo stato di superavvolgimento in cui si trova una molecola di DNA è definito topologia. Se il DNA si avvolge nella direzione dell'elica, si parla di superavvolgimento positivo, con le basi strette tra loro in modo più marcato. In caso contrario, si parla di superavvolgimento negativo. In natura, la maggior parte delle molecole di DNA presentano un lieve superavvolgimento negativo, introdotto da enzimi definiti topoisomerasi. Questi enzimi sono anche necessari in processi come la trascrizione e la replicazione del DNA, dal momento che sono in grado di risolvere gli stress topologici indotti dai processi stessi.

Funzioni biologiche

Negli eucarioti, il DNA è solitamente presente all'interno di cromosomi lineari (circolari nei procarioti). La somma di tutti i cromosomi di una cellula ne costituisce il genoma; il genoma umano conta circa 3 miliardi di paia di basi contenute in 46 cromosomi. L'informazione è conservata in sequenze di DNA chiamate geni. La trasmissione dell'informazione contenuta nei geni è garantita dalla presenza di sequenze di basi azotate

Una T7 RNA polimerasi (blu) mentre produce una molecola di mRNA (verde) a partire da uno stampo di DNA (arancione).

complementari. Infatti, durante la trascrizione, l'informazione può essere facilmente copiata in un filamento complementare di RNA. Solitamente, tale copia di RNA è utilizzata per sintetizzare una proteina, attraverso un processo definito traduzione (o sintesi proteica). In alternativa, una cellula può semplicemente duplicare l'informazione genetica attraverso un processo definito replicazione del DNA.

Struttura del genoma

Negli organismi eucarioti, il DNA genomico è localizzato all'interno del nucleo cellulare, nonché in piccole quantità all'interno di mitocondri e cloroplasti. Nei procarioti, il DNA è invece racchiuso in un organello irregolare, privo di membrana, contenuto nel citoplasma, chiamato nucleoide.L'informazione è contenuta all'interno dei geni, unità ereditarie in grado di influire sul fenotipo dell'organismo. Ogni gene contiene un open reading frame (regione in grado di essere trascritta a RNA) ed una regione regolatoria, costituita sia da un promotore che da enhancers.

In molte specie, solo una piccola frazione della sequenza totale di un genoma può essere trascritta e tradotta. Ad esempio, solo l'1.5% del genoma umano è costituito da esoni codificanti per una proteina, mentre più del 50% consiste di sequenze ripetute di DNA non codificante. La ragione per cui ci sia una tale quantità di DNA non codificante non è tuttora completamente chiara ed è stata definita come enigma del C-value. In ogni caso, le sequenze di DNA che non codificano per una proteina possono essere trascritte in RNA non codificante, coinvolto nella regolazione dell'espressione genica.

Alcune sequenze non codificanti ricoprono un ruolo strutturale per i cromosomi. Le regioni telomeriche e centromeriche contengono solitamente pochissimi geni, ma sono necessarie per la funzione e la stabilità dei cromosomi. Nell'uomo, grandi quantità di DNA non codificante si ritrovano negli pseudogeni, copie di geni rese inattive dalla presenza di una mutazione. Queste sequenze sono considerate come fossili molecolari, anche se esistono evidenze secondo le quali si può ipotizzare che siano una sorta di materiale grezzo necessario per la creazione di nuovi geni attraverso i processi di duplicazione genica e di evoluzione divergente.

Trascrizione e traduzione

Un gene è una sequenza di DNA che contiene le informazioni in grado di influire sulle caratteristiche del fenotipo dell'organismo. All'interno di un gene, la sequenza di basi di DNA è utilizzata come stampo per la sintesi di una molecola di RNA che, nella maggior parte dei casi, è tradotta in una molecola peptidica.

Il meccanismo attraverso il quale la sequenza nucleotidica di un gene è copiata in un filamento di RNA è detto trascrizione ed avviene per mezzo dell'enzima RNA polimerasi. Il filamento di RNA può andare incontro a destini differenti: alcune molecole di RNA hanno, infatti, funzioni di tipo strutturale (come quelle che si trovano all'interno del ribosoma) o catalitica (molecole note come ribozimi); la maggior parte degli RNA, tuttavia, subiscono un processo di maturazione per produrre mRNA, molecole destinate ad esser tradotte in proteina.

Il processo di traduzione avviene nel citoplasma, dove gli mRNA si associano ai ribosomi, ed è mediato dal codice genetico. Il ribosoma permette la lettura sequenziale dei codoni del mRNA, favorendone il riconoscimento e l'interazione con specifici tRNA, molecole che trasportano gli amminoacidi corrispondenti ad ogni singolo codone.

Il codice genetico

Il codice genetico consiste di parole di tre lettere chiamate codoni, costituite dalla sequenza di tre nucleotidi (ad esempio ACT, CAG, TTT), ognuna delle quali è associata ad un particolare amminoacido. Ad esempio la timina ripetuta in una serie di tre (TTT) codifica per la fenilalanina. Utilizzando gruppi di tre lettere si possono avere fino a 64 combinazioni diverse ( $43$ ), in grado di codificare per i venti diversi amminoacidi esistenti. Poiché esistono 64 triplette possibili e solo 20 amminoacidi, il codice genetico è detto ridondante (o degenere): alcuni amminoacidi possono infatti essere codificati da più triplette diverse. Non è invece vero il contrario: ad ogni tripletta corrisponderà un solo amminoacido (senza possibilità di ambiguità). Esistono infine tre triplette che non codificano per nessun amminoacido, ma rappresentano codoni di stop (o nonsense), ovvero indicano il punto in cui, all'interno del gene, termina la sequenza che codifica per la proteina corrispondente: si tratta dei codoni TAA, TGA e TAG.

La replicazione del DNA. La doppia elica è aperta dalle elicasi e dalle topoisomerasi. In seguito, una DNA polimerasi genera un filamento complementare sul filamento veloce. Un'altra DNA polimerasi lega invece il filamento lento, generando segmenti discontinui (detti frammenti di Okazaki) che verranno uniti da una DNA ligasi

Replicazione

La divisione cellulare, necessaria ad un organismo per crescere, richiede una duplicazione del DNA cellulare, in modo che le cellule figlie possano avere la stessa informazione genetica della cellula madre. La struttura a doppia elica del DNA permette un meccanismo estremamente semplice per la replicazione del DNA. I due filamenti, infatti, sono separati e da ognuno viene creato un filamento complementare, ad opera di un enzima chiamato DNA polimerasi. Con questo meccanismo, le basi presenti sul filamento figlio sono determinate da quelle presenti sul filamento parentale: è proprio attraverso questo meccanismo che le cellule figlie presentano genoma identico alla cellula madre (salvo errori avvenuti durante il processo, che portano alla comparsa di mutazioni). Tale tipo di replicazione, che porta a doppie eliche costituite da un filamento preesistente e uno neoformato è detta semiconservativa.

Per iniziare la replicazione, occorre anzitutto l'apertura della forca replicativa, attraverso la parziale denaturazione del DNA a doppia elica, portata a termine dalle elicasi e dalle single-strand-binding proteins (SSBPs): le elicasi sono enzimi che separano attivamente i due filamenti usando l'energia dell'ATP; le SSBPs sono in grado di mantenere la denaturazione del DNA legandosi esclusivamente alle porzioni a singolo filamento e stabilizzandole. Nelle molecole di DNA circolari dei procarioti si ha una sola regione di origine della replicazione dalla quale partono due forche replicative (la struttura prende il nome di bolla di replicazione). Quando le due forche si incontrano dal lato opposto la replicazione è completata. Negli eucarioti la replicazione di ogni cromosoma inizia invece in più punti.

Le DNA polimerasi, enzimi capaci di costruire una nuova catena solo in direzione 5'-3', sono stati individuati per la prima volta da Arthur Kornberg, il quale, grazie ad un suo famoso esperimento,identificò la DNA polimerasi I in Escherichia coli. La reazione della DNA polimerasi è diretta dallo stampo, perché produce un nuovo filamento di DNA esattamente complementare ad uno preesistente che funge, appunto, da stampo. La DNA polimerasi non è in grado di iniziare la sintesi di un filamento ex novo, mentre può allungare un filamento polinucleotidico preesistente. In una cellula in replicazione, dunque, è indispensabile la presenza di un filamento preesistente (detto primer), che consiste solitamente in un breve segmento di RNA complementare allo stampo, sintetizzato da enzimi specifici detti primasi.

Dal momento che le DNA polimerasi sono in grado di svolgere la loro attività solo in direzione 5'-3', esse hanno messo a punto diversi meccanismi per copiare i due filamenti della doppia elica. Un filamento (chiamato filamento veloce) può essere replicato in modo quasi continuo, man mano che viene esposto, l'altro (filamento lento) risulta invece disseminato da brevi filamenti di DNA di nuova sintesi (i frammenti di Okazaki), ognuno dei quali presenta un innesco iniziale di RNA. I nuovi filamenti devono essere quindi completati mediante la rimozione degli inneschi da parte di endonucleasi e il riempimento degli spazi rimasti ad opera di polimerasi di riparazione. Successivamente tutti questi frammenti di DNA di nuova sintesi del filamento lento vengono legati dalle DNA ligasi.

Interazioni con proteine

Tutte le funzioni del DNA dipendono dalle sue interazioni con specifiche proteine. Tali interazioni possono sia essere aspecifiche, sia prevedere un legame estremamente specifico della proteina ad una singola sequenza di DNA. Sono numerosi anche gli enzimi che possono legare il DNA e, tra questi, sono particolarmente importanti le polimerasi che copiano le sequenze nella trascrizione e nella replicazione del DNA.

Proteine che legano il DNA

Interazione del DNA con gli istoni (in bianco, nell'immagine in alto). Gli amminoacidi basici di queste proteine (in blu nell'immagine in basso a sinistra) legano in modo non covalente i gruppi fosfato del DNA, acid (in rosso in basso a destra).

Le proteine strutturali che legano il DNA sono esempi delle interazioni aspecifiche tra DNA e proteine. All'interno dei cromosomi, il DNA è associato a complessi di natura proteica, che si organizzano tra loro a formare una struttura compatta chiamata cromatina. Negli eucarioti, questa struttura presuppone il legame del DNA a piccoli complessi proteici basici chiamati istoni; nei procarioti, invece, sono coinvolti diversi tipi di differenti proteine. Gli istoni formano un complesso a forma di disco chiamato nucleosoma, che instaura interazioni di tipo ionico (tra i residui basici degli istoni e lo scheletro fosforico acido del DNA) con circa duecento paia di basi di DNA, che si avvolgono intorno al disco formando due giri completi, indipendentemente dalla sequenza che li caratterizza. Questi residui basici possono subire metilazioni, fosforilazioni e acetilazioni: tali modificazioni chimiche alterano l'interazione tra gli istoni e il DNA, rendendolo così più o meno accessibile ai fattori di trascrizione e modulando la velocità della trascrizione stessa. Altre DNA-binding proteins (DNAbp) di tipo aspecifico, anch'esse presenti nella cromatina, sono le high-mobility group proteins, che legano preferenzialmente il DNA ripiegato o distorto. Queste proteine hanno un ruolo fondamentale nel ripiegamento delle file di nucleosomi e nel loro impacchettamento all'interno di strutture cromatiniche più complesse.Un ulteriore gruppo di DNAbp sono le single-strand-binding proteins (SSBP), che si legano esclusivamente ad una molecola di DNA a singolo filamento. Nell'uomo, la RPA (replication protein A) è il membro meglio caratterizzato di questa famiglia ed è essenziale per la maggior parte dei processi che richiedono una separazione della doppia elica, tra cui la replicazione del DNA, la sua ricombinazione e la sua riparazione. Queste DNAbp sono in grado di stabilizzare la forma a singolo filamento, impedendo che la molecola si ripieghi a formare stem loops o venga degradata dall'azione delle nucleasi.

Il repressore lambda, con la sua caratteristica struttura elica-giro-elica, legato al proprio DNA bersaglio

A differenze di quelle finora presentate, esistono anche numerose proteine che legano specificamente determinate sequenze di DNA. Quelle maggiormente studiate sono i fattori di trascrizione (TF), proteine in grado di regolare la trascrizione. Ognuna di esse si lega ad una o più sequenze specifiche, poste solitamente nei pressi del promotore di un gene, attivando o inibendo la trascrizione del gene stesso. Tale processo viene svolto attraverso due tipi di meccanismo: anzitutto, i TF sono in grado di legare, direttamente o attraverso proteine adattatrici, la RNA polimerasi responsabile della trascrizione, localizzandola presso il sito di inizio della trascrizione e favorendone dunque l'avvio; un'altra modalità consiste nel legame tra i TF ed enzimi in grado di modulare metilazioni ed acetilazioni degli istoni presenti presso il promotore, modificando dunque l'accessibilità di quella regione alla polimerasi. Dal momento che un TF può avere numerose sequenze bersaglio, cambiamenti di attività di un TF possono avere effetti sull'espressione di migliaia di geni.Di conseguenza, queste proteine sono spesso i bersagli finali delle cascate di trasduzione del segnale, che mediano le risposte cellulari agli stimoli interni ed esterni alla cellula. La specificità dei TF per il DNA è legato ai contatti multipli che si instaurano tra la proteina ed il solco maggiore, dove le basi azotate sono maggiormente accessibili.

Enzimi che modificano il DNA

Nucleasi e ligasi

Le nucleasi sono enzimi in grado di tagliare filamenti di DNA, dal momento che catalizzano l'idrolisi del legame fosfodiesterico. Le nucleasi che idrolizzano il DNA partendo dai nucleotidi situati alle estremità dei filamenti sono definite esonucleasi. Sono endonucleasi, invece, quelle che tagliano direttamente all'interno del filamento. Le nucleasi più utilizzate in biologia molecolare, dette enzimi di restrizione, tagliano il DNA in corrispondenza di specifiche sequenze. L'enzima EcoRV, ad esempio, riconosce la sequenza di sei basi

5′-GAT|ATC-3′ ed effettua il taglio presso la linea verticale. In natura, questo enzima protegge i batteri dalle infezioni fagiche, digerendo il DNA del fago quando esso fa il suo ingresso nella cellula batterica Generalmente, le nucleasi di restrizione riconoscono particolari sequenze nucleotidiche palindromiche, note come siti di restrizione, nelle quali la stessa sequenza si ripete in direzioni opposte sulle due eliche complementari, e quindi producono dei tagli su entrambi i filamenti. Tali enzimi sono utilizzati ampiamente nelle tecniche che prevedono il subclonaggio di DNA all'interno di vettori.

Le DNA ligasi sono enzimi in grado di riunire filamenti di DNA precedentemente tagliati o spezzati, utilizzando energia chimica proveniente da ATP o da NAD. Le ligasi sono particolarmente importanti nella replicazione del filamento lento, dal momento che esse riuniscono i frammenti di Okazaki in un filamento unico. Esse rivestono un ruolo importante anche nella riparazione del DNA e nella ricombinazione genetica.

Topoisomerasi ed elicasi

Le topoisomerasi sono enzimi che presentano sia un'attività nucleasica che una ligasica. Queste proteine sono in grado di modificare le proprietà topologiche del DNA. Alcune di esse svolgono tale funzione tagliando l'elica di DNA e permettendole di ruotare, riducendo il suo grado di superavvolgimento, per poi procedere alla ligazione delle due estremità. Altre topoisomerasi sono invece in grado di tagliare l'elica e far passare attraverso il sito di rottura una seconda elica, prima di ligare il filamento spezzato. Le topoisomerasi sono necessarie per molti processi che coinvolgono il DNA, come ad esempio la replicazione del DNA e la trascrizione.

Le elicasi sono proteine in grado di utilizzare l'energia chimica presente nei nucleosidi trifosfato, soprattutto ATP, per rompere i legami idrogeno che si instaurano tra le basi azotate, permettendo l'apertura della doppia elica di DNA in singoli filamenti. Questi enzimi sono essenziali per la maggior parte dei processi biologici che coivolgono enzimi che richiedono un diretto contatto con le basi del DNA.

Polimerasi

Le polimerasi sono enzimi che sintetizzano catene polinucleotidiche a partire dal nucleosidi trifosfato. Esse funzionano aggiungendo nucleotidi al 3′-OH del precedente nucleotide presente sul filamento. Come conseguenza di ciò, tutte le polimerasi lavorano in direzione 5′->3′. Nel sito attivo di questi enzimi, il nucleoside trifosfato si appaia ad un nucleotide presente su un filamento usato come stampo: ciò permette alle polimerasi di sintetizzare in modo accurato filamenti fedelmente complementari agli stampi. Le polimerasi sono classificate sulla base del tipo di stampo che utilizzano.

La replicazione del DNA richiede una DNA polimerasi DNA-dipendente, in grado cioè di realizzare una perfetta copia di una sequenza di DNA. L'accuratezza è fondamentale in questo processo, motivo per cui molte di queste polimerasi presentano anche un'attività di proofreading (dall'inglese, correzione di bozze). Esse sono infatti in grado di rilevare un errore di appaiamento (o mismatch) tra basi azotate ed attivare un'azione 3' o 5' esonucleasica per rimuovere la base scorretta. Nella maggior parte degli organismi, le DNA polimerasi funzionano all'interno di un più ampio complesso proteico definito replisoma, che consiste anche di numerose subunità accessorie come ad esempio le elicasi. Le DNA polimerasi RNA-dipendenti sono una classe di polimerasi specializzate nella sintesi di una copia di DNA, usando come stampo un frammento di RNA. Tra di esse figurano la trascrittasi inversa, un enzima virale coinvolto nell'infezione dei retrovirus, e la telomerasi, necessaria per la replicazione dei telomeri. La telomerasi è una polimerasi inusuale, dal momento che contiene una sequenza stampo di RNA all'interno della propria struttura. La trascrizione è invece svolta da RNA polimerasi DNA-dipendenti, che legano il DNA presso il promotore di un gene e separano i due filamenti. Successivamente, l'enzima genera una molecola di mRNA fino al raggiungimento del terminatore, dove si interrompe la trascrizione e l'enzima si distacca dal DNA. Come avviene per le DNA polimerasi DNA-dipendenti, anche queste polimerasi operano all'interno di un ampio complesso proteico, composto di molecole accessorie e regolatorie.

Ricombinazione genetica

La ricombinazione consiste di una rottura e successiva riunione di due cromosomi (M ed F) a produrre due cromosomi riarrangiati (C1 e C2).

crossing-over, che permette la ricombinazione genetica attraverso la rottura di due eliche, lo scambio di segmenti tra di esse ed il ricongiungimento finale. La ricombinazione permette ai cromosomi di scambiare informazioni genetiche e produrre nuove combinazioni di geni, con il risultato di aumentare l'efficienza della selezione naturale e di facilitare l'evoluzione di nuove proteine. La ricombinazione genetica può anche essere coinvolta nella riparazione del DNA, in particolare come risposta cellulare in seguito a rotture a doppio filamento. La principale forma di crossing-over

Un filamento di DNA solitamente non interagisce con altri segmenti di DNA e, nelle cellule umane, i differenti cromosomi occupano addirittura regioni separate del nucleo (territori cromosomici).^[111] Tale separazione fisica è fondamentale per permettere al DNA di essere un archivio stabile e sicuro dell'informazione genetica. L'interazione tra diversi segmenti di DNA è invece possibile e frequente attraverso il fenomeno del crossing-over, che permette la ricombinazione genetica attraverso la rottura di due eliche, lo scambio di segmenti tra di esse ed il ricongiungimento finale. La ricombinazione permette ai cromosomi di scambiare informazioni genetiche e produrre nuove combinazioni di geni, con il risultato di aumentare l'efficienza della

Struttura di una giunzione di Holliday, intermedio di una reazione di ricombinazione genetica. I quattro singoli filamenti di DNA sono colorati di rosso, blu, verde e giallo.

selezione naturale e di facilitare l'evoluzione di nuove proteine. La ricombinazione genetica può anche essere coinvolta nella riparazione del DNA, in particolare come risposta cellulare in seguito a rotture a doppio filamento. La principale forma di crossing-over cromosomico è la ricombinazione omologa, nella quale i due cromosomi coinvolti condividono sequenze molto simili. Le ricombinazioni non omologhe, invece, possono essere dannose per la cellula, perché in grado di produrre traslocazioni cromosomiche e anomalie genetiche. La reazione di ricombinazione è catalizzata da enzimi noti come ricombinasi. Il primo passaggio del processo di ricombinazione consiste nella rottura a singolo filamento provocata da una endonucleasi o da un danno al DNA. Una serie di passaggi successivi, in parte catalizzati dalla ricombinasi, porta all'unione tra due eliche attraverso la formazione di una giunzione di Holliday, nella quale un segmento a singolo filamento di ogni elica è appaiato al filamento complementare presente sull'altra elica. La reazione di ricombinazione è quindi interrotta dalla rottura della giunzione e dalla re-ligazione del DNA così ottenuto.L'esistenza della giunzione di Holliday è stata dimostrata da fotografie al microscopio elettronico di molecole di DNA in ricombinazione.

Evoluzione del metabolismo del DNA

Il DNA contiene l'informazione genetica che permette a tutti gli organismi viventi (esclusi i virus, la cui ammissibilità tra i viventi è tuttavia ampiamente dibattuta) di funzionare, crescere e riprodursi. In ogni caso, non è stato ancora chiarito in quale momento della storia della vita il DNA abbia assunto tale ruolo fondamentale. È generalmente accettato dalla comunità scientifica, infatti, l'ipotesi che il DNA non sia stato il primo acido nucleico ad essere utilizzato dai viventi: tale ruolo spetterebbe infatti all'RNA. L'RNA potrebbe aver giocato un ruolo centrale del metabolismo cellulare ancestrale, dal momento che può avere sia un ruolo nella conservazione dell'informazione genetica, sia uno catalitico (ad esempio attraverso i ribozimi), sia uno strutturale (all'interno dei ribosomi). Il mondo a RNA, basato su un unico tipo di molecola avente funzioni genetiche, catalitiche e strutturali, potrebbe avere avuto un'influenza sullo sviluppo dell'attuale codice genetico, basato proprio su quattro nucleotidi. Tale numero potrebbe essere un compromesso tra la necessità da una parte di ridurre la quantità di basi possibili, per migliorare l'accuratezza della replicazione, e dall'altra di aumentarla, per incrementare l'efficacia catalitica dei ribozimi.

In ogni caso, non esistono prove evidenti di questo sistema genetico ancestrale, dal momento che è impossibile recuperare DNA dai fossili. Ciò è dovuto al fatto che il DNA può sopravvivere nell'ambiente per meno di un milione di anni e, se in soluzione, si degrada rapidamente in piccoli frammenti. Sebbene ci siano stati diversi annunci di scoperte di DNA antichissimo, tra cui quella relativa all'isolamento di un batterio vivo da un cristallo di sale risalente a 250 milioni di anni fa, queste affermazioni sono ancora controverse e oggetto di discussione

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Utilizzi del DNA

Ingegneria genetica

La moderna biologia e biochimica fa un uso intensivo del DNA. Con il termine di DNA ricombinante ci si riferisce a segmenti di DNA realizzati e assemblati artificialmente. Essi possono essere inseriti all'interno di organismi viventi sotto forma di plasmidi o mediante altri tipi di vettori. Gli organismi così prodotti sono detti geneticamente modificati e possono essere utilizzati per la produzione di proteine ricombinanti, necessarie per la ricerca biomedica,o per le coltivazioni agricole.

Medicina forense

La medicina forense si serve del DNA, generalmente isolato dal sangue, dalla pelle, dalla saliva, dai capelli e da altri tessuti e fluidi biologici, per identificare i responsabili di atti criminosi, come delitti o violenze. Il processo utilizzato è il fingerprinting genetico: tale tecnica consiste nel comparare la lunghezza delle sezioni variabili del DNA ripetitivo, come le short tandem repeats ed i minisatelliti, che possono risultare molto diverse tra un individuo e l'altro. La comparazione tra due campioni di DNA in esame, non si basa perciò sull'analisi di tutta la sequenza desossiribonucleotidica, ma solo su tali sezioni. Infatti, due individui non legati da rapporti di parentela hanno in comune ben il 99,9% di sequenza di DNA. Tale metodo è solitamente molto affidabile, anche se a volte l'identificazione dei criminali può risultare complicata qualora la scena sia contaminata dal DNA di diverse persone. Questo metodo, sviluppato nel 1984 dal genetista britannico Sir Alec Jeffreys,^[ fu usato per la prima volta nel 1988 per incriminare Colin Pitchfork. Nella pratica attuale, spesso i sospettati sono invitati a fornire un campione di DNA per il confronto con eventuali reperti biologici presenti sulla scena del delitto. Il fingerprinting genetico può essere utilizzato anche per identificare le vittime di incidenti di massa.

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La reazione della polimerasi

PCR

La reazione a catena della polimerasi (in inglese: Polymerase Chain Reaction), comunemente nota con l'acronimo PCR, è una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni.Tale metodica fu ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).

Meccanismo di funzionamento

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Schema delle fasi di una PCR:
1. Denaturazione
2. Annealing
3. Allungamento
4. Termine del ciclo

La PCR ricostruisce in vitro uno specifico passaggio della riproduzione cellulare: la ricostituzione (sintesi) di un segmento di DNA "completo" (a doppia elica) a partire da un filamento a singola elica. Il filamento mancante viene ricostruito a partire da una serie di nucleotidi (i "mattoni" elementari che costituiscono gli acidi nucleici) che vengono disposti nella corretta sequenza, complementare a quella del DNA interessato.Questo processo viene svolto in natura da enzimi chiamati DNA-polimerasi, che sono in grado di sintetizzare progressivamente un nuovo filamento di DNA nelle seguenti condizioni:

devono essere disponibili i nucleotidi da polimerizzare, sotto forma di desossiribonucleotidi trifosfati (dNTP);
il DNA deve essere denaturato, ovvero le due eliche che compongono i filamenti devono essere già separate;

· il segmento da ricostruire può essere soltanto prolungato, ovvero non è possibile sintetizzare un nuovo filamento a partire da zero;

· devono inoltre essere rispettate opportune condizioni di temperatura, pH, ecc.

È possibile quindi ricostruire le condizioni che portano alla formazione dei nuovi segmenti di DNA, ponendo in soluzione:

una quantità, anche minima, del segmento di DNA che si desidera riprodurre;
una quantità opportuna di nucleotidi liberi per costituire i nuovi filamenti;
opportuni "inneschi", detti primer, costituiti da brevi sequenze di DNA (oligonucleotidi) complementari agli estremi 5’ e 3’ del segmento da riprodurre;
altri elementi di supporto (ad es. ioni magnesio), necessari per costituire l'ambiente adatto alla reazione;
una DNA polimerasi (non è necessario che provenga dallo stesso organismo di cui si deve replicare il DNA).

Per avviare la reazione della polimerasi (fase di prolungamento del filamento a partire dal primer 5’) è prima necessario provvedere alla separazione dei filamenti del DNA (fase di denaturazione), quindi alla creazione del legame tra i primer e le regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati (fase di annealing). Questo processo risulta però incompatibile con la DNA polimerasi umana, che viene distrutta alle temperature necessarie alla denaturazione (96-99 °C).

Per ovviare a questo inconveniente si fa ricorso alle polimerasi appartenenti a organismi termofili che non sono inattivate dalle alte temperature, ad esempio la Taq polimerasi proveniente dal batterio termofilo Thermus aquaticus. Ciò consente di realizzare più cicli di PCR in sequenza, in ciascuno dei quali viene duplicato anche il DNA sintetizzato nelle fasi precedenti, ottenendo una reazione a catena che consente una moltiplicazione estremamente rapida del materiale genetico di interesse.

Schema di un ciclo di PCR

La soluzione di DNA da replicare, desossiribonucleotidi trifosfati, ioni magnesio, primer e DNA polimerasi viene portata a una temperatura compresa tra 94 e 99 °C. Ci si trova, di conseguenza, in una situazione in cui la doppia elica del DNA viene completamente scissa ed i due filamenti di cui essa è composta sono liberi (fase di denaturazione).
Successivamente la temperatura viene abbassata fino a 30-55 °C circa al fine di permettere il legame dei primer alle regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati (fase di annealing).
Infine la temperatura viene alzata fino a 65-72 °C al fine di massimizzare l'azione della DNA polimerasi che determina un allungamento dei primer legati, utilizzando come stampo il filamento singolo di DNA (fase di prolungamento).

Il ciclo descritto viene ripetuto generalmente per circa 20-30 volte. In genere non si superano i 50 cicli in quanto ad un certo punto la quota di DNA ottenuto raggiunge un plateau. Ciò avviene, ad esempio, per carenza degli oligonucleotidi usati come inneschi o per diminuzione dei dNTP. Bisogna inoltre considerare che si potrebbe amplificare in maniera eccessiva anche eventuale materiale genomico contaminante.

Allestimento di una PCR

Prima di effettuare questo tipo di analisi bisogna sapere…….

Norme di sicurezza

Non è consentito nell’area di lavoro : mangiare, bere, fumare e applicare cosmetici. Si raccomanda fortemente di indossare guanti e occhiali di protezione.

Gli studenti devono lavarsi le mani con sapone prima e dopo l’esercitazione. Nell’ eventualità uno dei reagenti dovesse andare negli occhi di uno studente , lavare accuratamente per 15’. Sebbene il colorante Fast-blast non sia tossico è necessario indossare i guanti di lattice per non macchiarsi le mani durante la colorazione del gel. E’ necessario indossare il camice o altri indumenti protettivi.

Volumi e misurazioni

Si utilizzano pipette a volume variabile da 2-20 µl e da 20-200 µl da 100-1000 µl con puntali adattabili. Pipette Pasteur sterili graduate da 50 µl fino a 1000 µl, la pipetta DPTP è tarata per la misurazione di questi volumi, per volumi superiori a questi sono richieste più misurazioni.

Come devono essere trattati mortai e pestelli

Il materiale in esame in questa tecnica viene usato dopo essere stato pestato e macinato in un mortaio con pestello. A questo scopo bisogna utilizzare il materiale assolutamente pulito ed esente dalla presenza di sostanze chimiche che potrebbero interferire con la PCR. L’attrezzatura va sciacquata con candeggina al 10% che rimuove completamente qualsiasi traccia di DNA. L ’attrezzatura deve essere risciacquata molto accuratamente per eliminare tutte le tracce di candeggina, ripetendo l’operazione per la preparazione di ogni campione.

Estrazione del DNA da campioni di alimenti

Il problema di questa parte dell’esperimento è la quantità e la qualità del DNA estratto dal campione di cibo. L’affidabilità dell’estrazione del DNA dal campione riguarda il tipo di cibo preso in considerazione, infatti alcuni cibi danno una migliore resa di DNA estratto e migliori risultati della PCR e sono perciò consigliati (grano fresco, papaya fresca,pane di grano, farina di grano, dolci, farina di soya=più indicati ). I cibi in cui l’affidabilità è meno alta ,la PCR produce nastri più deboli.Per poter riscontrare la presenza di OGM si sconsiglia l’utilizzo di grano, farine e fette biscottate , riso ,frutta e vegetali che quasi certamente (in base alle normative vigenti) risulteranno negativi . gli alimenti dove è più probabile riscontrare la presenza di OGM sono soia , mais e derivati e papaya.

La prevenzione della contaminazione

Bisogna ricordare che le postazioni di lavoro delle varie fasi ,devono essere diverse e lontane una dall’altra; quando si è utilizzato pestello e mortaio devono essere subito lavati con candeggina e risciacquati molto accuratamente, i puntali ,le pipette monouso devono essere posti in beker contenenti candeggina in modo da distruggere il DNA residuo o eventuali contaminazioni da parte dei reagenti. Dobbiamo ancora ricordare di stare attenti alla contaminazione, usando puntali nuovi ad ogni passo e chiudere con il tappo le provette a meno di non dover aggiungere dei reagenti.

La funzione della matrice InstaGene

La matrice di InstaGene è una sospensione caricata negativamente,contenente perline microscopiche che legano cationi bivalenti come il Magnesio (Mg), è importante rimuovere i cationi bivalenti dall’estratto di DNA perché questi aiutano gli enzimi che degradano il DNA. Quando le cellule sono lisate e portate a 95°C per 5’, in presenza del reagente InstaGene i cationi bivalenti si separano dalle cellule e si legano alle perline e il calore inattiva gli enzimi DNA- degradanti. Le perline sono raggruppate dalla centrifugazione e il surnatante, che contiene il DNA genomico pulito e intatto, può essere usato come sagoma nelle reazioni PCR. Le perline nell’InstaGene devono essere separate velocemente dalla sospensione. È quindi estremamente importante che la provetta della matrice sia mescolata completamente prima di pipettare la quantità utilizzate per ciascuna postazione di lavoro in modo che ognuna di esse contenga la stessa quantità di perline. Se i campioni di DNA non sono sottoposti ad amplificazione entro 24h, possono essere immagazzinati in frigorifero per una settimana. Per periodi più lunghi, mettere i campioni nel freezer per prevenire la degradazione del DNA. Prima che i campioni siano usati per la PCR le perline devono essere separate con la centrifugazione prima che siano effettuate le reazioni della PCR.

È importante rimuovere subito l’InstaGene matrice.

E’ estremamente importante che le perline si appallottolino insieme al lisato e che si separi prima della reazione della PCR. L’agglomerato di perline lega e rimuove i cationi bivalenti che sono essenziali per l’azione della Taq polimerasi. Infatti se alcuni agglomerati dovessero essere presenti durante la reazione della PCR, questa potrebbe non verificarsi. La matrice InstaGene può essere efficacemente separata grazie alla centrifugazione a 6000 giri per 5’ e subito dopo il surnatante deve essere separato attentamente senza che le perline si rimescolino.

Che cosa è il master mix

Il master mix è una miscela di nucleotidi, dNTPs , tampone e Taq polimerasi del DNA. La miscela pronta per l’uso è preparata aggiungendo gli inneschi solo prima dell’uso. Aggiungendo 20 µl della maschera a 20 µl della miscela master mix ,tutti i componenti necessari alla reazione della PCR sono presenti (40 µl di miscela). Si ricorda che una volta preparata questa miscela va posta in ghiaccio e utilizzata entro 30’-1h al massimo. Questi reagenti sono molto sensibili.

Perché gli inneschi sono rossi e verdi

Le miscele di innesco (primers) sono colorate e sono compatibili con la reazione PCR, il colore consente di visualizzare facilmente e distinguere master mix diverse, inoltre il colore migra durante l’elettroforesi effettuata su gel, rendendo più visibili le bande.

Tecnica della PCR

La tecnica della PCR può essere effettuata con il termociclatore o a mano, ma , in questo caso, potrebbe non essere efficace. Per l’amplificazione della PCR le provettine tappate e sigillate con una goccia di petrolio minerale, per evitare l’eventuale evaporazione, devono essere poste a bm per tempi ben determinati e a determinate temperature.

Temperatura	Tempo
95°C	1’
59°C	1’
72°C	2’

Questi cicli vanno ripetuti 40 volte con un tempo totale di 3h circa. Utilizzando un termociclatore è sufficiente impostare lo strumento , introdurre le provettine ed avviare il sistema e attendere che i cicli siano compiuti.

La PCR nel termociclatore

L’amplificazione della PCR avviene in un termociclatore che compie dei cicli in cui si alternano fasi di temperature alte a fasi di temperature più basse, tutte per tempi ben determinati. Questa esercitazione è composta da tre cicli: il DNA è sottoposto a denaturazione a 94°C per 1’; ricombinazione a 59°C per 1’; e l’estensione a 72°C per 2’. Questi cicli devono essere ripetuti 40 volte durante l’amplificazione della PCR. Durante la denaturazione il DNA si separa nei due filamenti in modo da consentire l’accesso ai primers (nucleotidi) della PCR. Durante la fase della ricombinazione, i primers della PCR riconoscono e si legano al filamento (maschera). Quando i primers sono legati, la Taq polimerasi attiva la fase di estensione nella quale il frammento del DNA viene replicato. La reazione della PCR può essere completata approssimativamente in 3,5h.

Le provette per la PCR sono molto piccole e devono essere maneggiate con cura. E’ importante chiudere completamente la provetta con il tappo prima di porla nel termociclatore, in quanto la soluzione contenuta nel suo interno potrebbe evaporare impedendo l’amplificazione. Non è necessario l’utilizzo di olio nelle celle termiche o nelle provette dei campioni. Le celle sono costituite per provvedere ad un contatto uniforme di calore con un volume standard di 200µl contenuto nelle provette della PCR. Non usare volumi di 500 µl nelle provette PCR con questi cicli termici. Il coperchio mantiene i campioni riscaldati ad una temperatura più alta del blocco campione durante tutti i cicli termici. Questo non permette al vapore acqueo di condensarsi sotto il tappo della provetta, riducendo così l’evaporazione e eliminando la necessità di utilizzare l’olio come sigillante.

Preparazione della miscela pronta per PCR

L’efficacia dell’amplificazione della miscela di master mix e DNA genomico decresce con una incubazione prolungata. Se i campioni da sottoporre alla amplificazione sono un certo numero, si consiglia di tenere a bagno in ghiaccio, le provette per non più di 1h prima dell’inizio dei cicli.

Le strisce elettroforetiche possono essere costituite da agarosio o polyacrylamide

I frammenti di DNA amplificati da promotori 35S e da terminator NOS sono rispettivamente 203 e 225 coppie di basi (bp). Il prodotto generato dalla PCR è il gene photosystem II di 455bp.Per i nastri di questa grandezza devono essere utilizzati , per l’elettroforesi, o il gel di agarosio al 3% oppure di polyacrylamide al 10%. In entrambe i casi sono mezzi che consentono eccellenti risultati, anche se le strisce di polyacrylamide sono più fragili , possono permettere, peraltro , una migliore separazione delle bande similari ottenute da test su alimenti contenenti entrambe i promoter CaMV35S (203bp) e NOS terminator (225bp), come nella papaia modificata geneticamente.

Colorante arancia G Loading

A tutti i campioni sottoposti ad amplificazione devono essere aggiunti 10 µl di colorante arancia G. Questo colorante è miscelato a glicerolo , la sua funzione è di rendere colorato il materiale , non interferisce con la striscia e migra allo stesso modo del campione. Il glicerolo, invece, ha la funzione di appesantire il materiale in esame aumentandone la densità e in questo modo lo fa ben aderire al gel di supporto.

Colorazione della migrazione

se si usa il gel di agarosio per l’elettroforesi, il colorante arancia G non è visibile durante la migrazione. Su gel di poliacrylamide l’OGM rosso è l’unico visibile durante la migrazione elettroforetica anche se è stato aggiunto il colorante arancia G.

L’ uso dell’Etidio- Bromuro per colorare la striscia

Questa tecnica è ottimizzata per l’uso del colorante Fast Blast DNA , non è tossico, e colora in modo sicuro. L’Etidio- Bromuro è il colorante tradizionalmente usato per visualizzare il DNA è più sensibile del Fast-Blast e da buoni risultati sulle strisce di gel. È riconosciuto che l’Etidio Bromuro è un mutageno e sospetto cancerogeno, richiede l’uso della luce UV per visualizzare il DNA. Uno svantaggio dell’uso dell’EB è che ,essendo più sensibile del FB, i risultati ottenuti dalla colorazione delle strisce migrate sul gel possono essere confuse con quelle colorate con FB. L’EB se utilizzato su strisce di agarosio deve avere una concentrazione di 0,05 µg/ml. Questa concentrazione produce il massimo del contrasto delle bande di amplificazione.

N.B.= la striscia colorata dopo elettroforesi va lavata in due vaschette con acqua calda

Analisi dei risultati

Perché i cibi etichettati come non GMO o organici compaiono come OGM positivi?

Esaminare il controllo OGM negativo come se fosse la prova, se il risultato non è difforme dall’aspettativa , non vi è stata contaminazione. In ogni caso bisogna considerare che il cibo non OGM nella maggior parte delle Nazioni può avere valori di OGM dall’1 al 5% , valori questi, riportati sull’etichetta. La prova della PCR è abbastanza sensibile per scoprire questi bassi livelli, i test per stabilire la percentuale di OGM nel cibo possono essere effettuati nei laboratori in tempo reale.

Perché il controllo non OGM risulta positivo?

Evidentemente non sono state applicate tutte le norme di sicurezza e prevenzione della contaminazione.

Perché non ho trovato il DNA ?

E’ possibile che siano stati commessi degli errori durante l’estrazione del DNA dal cibo campione, questo si può verificare ripetendo la procedura. Bisogna sempre ricordare che questo Kit è ottimizzato per la PCR su papaia, mais e soia da cui l’estrazione di DNA è migliore. Da altri tipi di cibo questa, risulta difficoltosa e talvolta inefficace.

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Tecnica di esecuzione della PCR su un campione di mais

Estrazione del DNA

Materiale occorrente:

vetreria e strumenti

Bilancia
Mortaio e pestello (lavati con candeggina al 10% sciacquati accuratamente e ,successivamente, sterilizzati)
Pipette di vetro sterili (10-5-2ml)
Pipette monouso
Provette monouso con tappo a vite
Heppendorf con tappo
Pipette automatiche a volume variabile con idonei puntali
Becker contenente candeggina al 10%
Bagno maria alla temperatura di 95°C
Minic entrifuga
Porta provettine (heppendorf e con tappo avvitabile)
Pipetta automatica a volume variabile (20 microlitri-500microlitri)

reagenti

Acqua distillata sterile
PMM (plant master mix) 12microlitri uniti a 600 microlitri di master-mix conservati a -20°C
GMM (GMO master-mix) 12microlitri uniti a 600 microlitri di master-mix conservati a -20°C
Campione di cibo OGM negativo: semi di soia non OGM
Campione di cibo in esame mais o papaya
Campione di cibo OGM positivo fornito nel kit
Insta-gene

Procedimento

Accendere il bagno maria e portare la temperatura a 95°C
Pesare, in successione e ponendo attenzione alle possibili contaminazioni, 0,5-2 g di cibo campione non –OGM fornito dal kit e di campione in esame
I campioni pesati verranno trattati nello stesso modo: porre nel mortaio il campione pesato e aggiungere ad ognuno 5ml di acqua distillata sterile per ogni g di cibo utilizzato
Con il pestello produrre una crema omogenea del cibo
Diluire il composto con altri 5ml di acqua distillata sterile
Nel porta provette tre provettine monouso con a tappo a vite e contrassegnarle per il campione in esame (OGM?) per il controllo positivo (OGM+ ) e per il controllo negativo (OGM-).
In ogni rispettiva provettina porre: 500 microlitri di Insta-gene e aggiungere 50 microlitri di campione ( OGM?, OGM+, OGM- )
Ricordiamo che la soluzione di insta-gene deve essere sempre, prima di ogni prelievo, miscelata accuratamente , per ottenere una buona distribuzione degli elementi in essa presenti
Le provette con i reagenti ,ben mescolati, vanno poi poste in bagno maria a 95°C per 5’
Togliere, trascorso il tempo indicato, le provette dal b.m. e porle in centrifuga a 6000 giri per 5’
Separare velocemente il surnatante di ogni provetta ponendolo, ognuno, in una provettina debitamente contrassegnata
Porre a congelare i diversi campioni così trattati solo nel caso che l’analisi si debba effettuare in altra data, altrimenti proseguire come indicato successivamente.

- microcentrifuga